Een fluorescentiefilter is een essentieel onderdeel van de fluorescentiemicroscoop. Een typisch systeem heeft drie basisfilters: een excitatiefilter, een emissiefilter en een dichroïsche spiegel. Ze worden gewoonlijk verpakt in een kubus, zodat de groep samen in de microscoop wordt geplaatst.
Hoe werkt een fluorescentiefilter?
Excitatiefilter
Excitatiefilters laten licht van een specifieke golflengte door en blokkeren andere golflengten. Ze kunnen worden gebruikt om verschillende kleuren te produceren door het filter zo af te stemmen dat er slechts één kleur doorlaat. De excitatiefilters zijn er in twee hoofdtypen: lange doorlaatfilters en banddoorlaatfilters. De exciter is gewoonlijk een banddoorlaatfilter dat alleen de golflengten doorlaat die door de fluorofoor worden geabsorbeerd, waardoor de excitatie van andere bronnen van fluorescentie wordt geminimaliseerd en excitatielicht in de fluorescentie-emissieband wordt geblokkeerd. Zoals weergegeven door de blauwe lijn in de figuur, is BP 460-495, wat betekent dat het alleen de fluorescentie van 460-495 nm kan passeren.
Het wordt binnen het verlichtingspad van een fluorescentiemicroscoop geplaatst en filtert alle golflengten van de lichtbron uit, behalve het fluorofoor-excitatiebereik. De minimale transmissie van het filter bepaalt de helderheid en helderheid van beelden. Voor elk excitatiefilter wordt een transmissie van minimaal 40% aanbevolen, zodat de transmissie idealiter >85% bedraagt. De bandbreedte van het excitatiefilter moet geheel binnen het excitatiebereik van de fluorofoor liggen, zodat de centrale golflengte (CWL) van het filter zo dicht mogelijk bij de piekexcitatiegolflengte van de fluorofoor ligt. De optische dichtheid (OD) van het excitatiefilter dicteert de duisternis van het achtergrondbeeld; OD is een maatstaf voor hoe goed een filter de golflengten buiten het transmissiebereik of de bandbreedte blokkeert. Een minimale buitendiameter van 3,0 wordt aanbevolen, maar een buitendiameter van 6,0 of groter is ideaal.
Emissiefilter
Emissiefilters dienen ervoor om de gewenste fluorescentie van het monster de detector te laten bereiken. Ze blokkeren kortere golflengten en hebben een hoge transmissie voor langere golflengten. Het filtertype is ook gekoppeld aan een nummer, bijvoorbeeld BA510IF in de figuur (interferentiebarrièrefilter), die aanduiding verwijst naar de golflengte bij 50% van de maximale transmissie.
Dezelfde aanbevelingen voor excitatiefilters gelden voor emissiefilters: minimale transmissie, bandbreedte, OD en CWL. Een emissiefilter met de ideale combinatie van CWL, minimale transmissie en OD zorgt voor de helderst mogelijke beelden, met de diepst mogelijke blokkering, en zorgt voor de detectie van de zwakste emissiesignalen.
Dichroïsche spiegel
De dichroïsche spiegel wordt onder een hoek van 45° tussen het excitatiefilter en het emissiefilter geplaatst en reflecteert het excitatiesignaal naar de fluorofoor terwijl het emissiesignaal naar de detector wordt verzonden. Ideale dichroïsche filters en bundelsplitsers hebben scherpe overgangen tussen maximale reflectie en maximale transmissie, met een >95% reflectie voor de bandbreedte van het excitatiefilter en een transmissie van >90% voor de bandbreedte van het emissiefilter. Selecteer het filter met de snijgolflengte (λ) van de fluorofoor in gedachten, om strooilicht te minimaliseren en de signaal-ruisverhouding van het fluorescerende beeld te maximaliseren.
De dichroïsche spiegel in deze figuur is de DM505, zo genoemd omdat 505 nanometer de golflengte is bij 50% van de maximale transmissie voor deze spiegel. De transmissiecurve voor deze spiegel vertoont een hoge transmissie boven 505 nm, een steile daling van de transmissie aan de linkerkant van 505 nanometer, en een maximale reflectiviteit aan de linkerkant van 505 nanometer, maar kan nog steeds enige transmissie hebben onder 505 nm.
Wat is het verschil tussen longpass- en bandpassfilters?
Fluorescentiefilters kunnen in twee typen worden verdeeld: lange doorlaat (LP) en banddoorlaat (BP).
Lange doorlaatfilters zenden lange golflengten uit en blokkeren de kortere. De cut-on-golflengte is de waarde bij 50% van de piektransmissie, en alle golflengten boven de cut-on worden door de langdoorlaatfilters doorgelaten. Ze worden vaak gebruikt in dichroïsche spiegels en emissiefilters. Longpass-filters moeten worden gebruikt wanneer de toepassing maximale emissieverzameling vereist en wanneer spectrale discriminatie niet wenselijk of noodzakelijk is, wat doorgaans het geval is voor probes die één enkele emitterende soort genereren in monsters met relatief lage niveaus van autofluorescentie op de achtergrond.
Banddoorlaatfilters zenden alleen een bepaalde golflengteband uit en blokkeren andere. Ze verminderen overspraak door alleen het sterkste deel van het fluorofoor-emissiespectrum door te laten, verminderen autofluorescentieruis en verbeteren zo de signaal-ruisverhouding in autofluorescentiemonsters met hoge achtergrond, die langdoorlaatfilters niet kunnen bieden.
Hoeveel soorten fluorescentiefiltersets kan BestScope leveren?
Enkele veel voorkomende typen filters zijn blauwe, groene en ultraviolette filters. Zoals weergegeven in de tabel.
| Filterset | Excitatiefilter | Dichroïsche spiegel | Barrièrefilter | Golflengte LED-lamp | Sollicitatie |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Fluorescerende antilichaammethode ·Acidine-oranje: DNA, RNA ·Auramine: tuberkelbacil ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescerende antilichaammethode ·Propidiumjodide: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Auto-fluorescentieobservatie ·DAPI: DNA-kleuring ·Hoechest 332528, 33342: gebruikt voor chromosomenkleuring |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Catecholaminen ·5-hydroxytryptamine ·Tetracycline: skelet, tanden |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filtersets die worden gebruikt bij fluorescentie-acquisities zijn ontworpen rond de belangrijkste golflengten die worden gebruikt in fluorescentietoepassingen, en zijn gebaseerd op de meest gebruikte fluoroforen. Om deze reden zijn ze ook vernoemd naar de fluorofoor waarvoor ze bedoeld zijn, zoals DAPI (blauw), FITC (groen) of TRITC (rood) filterkubussen.
| Filterset | Excitatiefilter | Dichroïsche spiegel | Barrièrefilter | Golflengte LED-lamp |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas rood | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mKers | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Hoe kies je een fluorescentiefilter?
1. Het principe van het selecteren van een fluorescentiefilter is om het fluorescentie-/emissielicht zo ver mogelijk door het beelduiteinde te laten gaan en tegelijkertijd het excitatielicht volledig te blokkeren, om de hoogste signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Vooral bij de toepassing van multifotonenexcitatie en totale interne reflectiemicroscopen zal de zwakke ruis ook grote interferentie met het beeldvormingseffect veroorzaken, waardoor de vereiste voor de signaal-ruisverhouding hoger is.
2. Ken het excitatie- en emissiespectrum van de fluorofoor. Om een fluorescentiefilterset te construeren die een hoogwaardig, contrastrijk beeld met een zwarte achtergrond genereert, moeten excitatie- en emissiefilters een hoge transmissie bereiken met minimale doorlaatbandrimpeling over de gebieden die overeenkomen met de excitatiepieken of emissies van de fluorofoor.
3. Houd rekening met de duurzaamheid van fluorescentiefilters. Deze filters moeten ongevoelig zijn voor intense lichtbronnen die ultraviolet (UV) licht genereren dat zou kunnen leiden tot “burn-out”, met name van het exciterfilter, aangezien dit wordt blootgesteld aan de volledige intensiteit van de verlichtingsbron.
De verschillende fluorescerende voorbeeldafbeeldingen
De bronnen worden verzameld en georganiseerd op internet en worden alleen gebruikt voor leren en communicatie. Als er sprake is van overtreding, neem dan contact met ons op om deze te verwijderen.
Posttijd: 09-dec-2022